Phương pháp hiệu giá kháng thể miễn dịch

1.  Nguyên tắc: 
Kháng thể miễn dịch thường kết hợp với kháng thể tự nhiên.Vì vậy muốn hiệu giá kháng thể miễn dịch phải tiến hành qua 2 giai đoạn:
- Trung hoà kháng thể tự nhiên bằng chất Witebsky hoặc khử kháng thể tự nhiên bằng cách đun nóng ở 70oC trong 10 phút.
- Tìm hiệu giá kháng thể miễn dịch có thể thực hiện một số kỹ thuật sau:
+ Phương pháp hiệu giá ở môi trường anbumin.
+ Nghiệm pháp coombs gián tiếp.
+ Kỹ thuật xử lý hồng cầu bằng men huỷ đạm papain, trypsin, bromelin.



2.   Chuẩn bị:
- Dụng cụ:  ống nghiệm nhỏ, lam kính, pipet.
 -Huyết thanh xét nghiệm 5 ml.
- Hồng cầu tươi nhóm Avà B lấy vào dung dịch chống đông,
- Huyết thanh nhóm máu AB.
- Chất Witebsky.
- Huyết thanh kháng glubolin người loại g globulin
- Huyết thanh chứng lấy ở người bình thường không có kháng thể miễn dịch.

3.Phương pháp tiến hành:
3.1. Kỹ thuật trung hoà kháng thể tự nhiên:
- Loại trừ kháng thể tự nhiên bằng sức nóng: trong ống nghiệm nhỏ số 1 cho:
+ 0,5ml huyết thanh xét nghiệm.
+ 0,5ml dung dịch nước muối 0,9%.

Trong ống nghiêm thứ 2 cho
+ 0,5ml huyết thanh chứng bình thường.
+ 0,5ml dung dich nước muối 0,9%
Lắc đều 2 ống nghiệm, cho vào thùng cách thuỷ 70oC trong 10 phút.
Kiểm tra xem đã khử hết kháng thể tự nhiên chưa, bằng cách cho tiếp xúc huyết thanh trên với hồng cầu A và B giống như hiệu giá kháng thể tự nhiên của nhóm O.Nếu ống 2 không thấy ngưng kết, chứng tỏ đã loại trừ được kháng thể tự nhiên.

- Hút kháng thể tự nhiên bằng chất  Witebsky: trong ống nghiệm thứ 3 cho:
+ 0,5ml huyết thanh xét nghiệm.
+ 0,5ml chất Witebsky.

Trong ống số 4 cho:
+ 0,5ml huyết thanh chứng bình thường.
+ 0,5ml chất Witebsky.
Lắc đều 2 ống trên rồi để tủ lạnh 40C trong một đêm, tuỳ theo quy định của hãng sản xuất chất Witebsky, kiểm tra xem đã hút hết kháng thể tự nhiên chưa (giống như trên). Sau đó hiệu giá huyết thanh đã khử kháng thể tự nhiên và đã được hút bởi chất Witebsky.

3.2. Kĩ thuật hiệu giá kháng thể miễn dịch kháng A và kháng B:
3.2.1. Phương pháp trong ống nghiệm:
- Chuẩn bị: Huyết thanh AB.

- Tiến hành: rửa hồng cầu A và B ba lần bằng dung dịch nước muối 0,9%. Sau lần rửa cuối cùng thì hút hết nước ở trên ra và pha thành hỗn dịch 5% với huyết thanh AB.

+ Dùng 20 ống nghiệm, chia làm hai dãy, pha loãng huyết thanh AB để có độ pha loãng 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/512, ổ mỗi ống cho 4 giọt huyết thanh đã pha loãng. Sau đó cho 2 giọt hồng cầu 5% vào mỗi ống. Đối với dãy A cho hồng cầu nhóm A. Đối với dãy B cho hồng câù nhóm B.

+ Lăc đều dung dịch trong ống nghiệm. Để tất cả hai dãy ống nghiệm vào trong bình cách thuỷ 37OC/1giờ. Quay li tâm 2000 vòng/phút trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm. Sau khi li tâm xong, phải để những ống nghiệm đó ở nhiệt độ 37OC trong 3 phút.

- Đọc kết quả: xem hiện tượng tan máu và  ngưng kết bằng mắt thường.

3.2.2. Phương pháp trên lam kính:
+ Cũng tiến hành pha loãng huyết thanh như trên.
+ Hỗn dịch hồng cầu pha 3% với huyết thanh AB.
+Nhỏ lên lam kính 2 giọt huyết thanh + 1 giọt hồng cầu. Trộn đều ở điều kiện ấm (37oC). Rồi xem hiện tượng ngưng kết bằng mắt thường.
- Kết quả: hiện nay việc tìm kháng thể miễn dịch có một số khó khăn về mặt nhận định kết quả với lý do:
+ Kỹ thuật trên không nhạy cảm do đó  khó phát hiện các kháng thể yếu.
+ Phương pháp trên ống nghiệm dễ gây tan máu.
+ Phương pháp trên lam kính thường thấy hiện tượng chuỗi tiền. Do  đó hiện nay người ta có thể dùng phương pháp khác như:
+Nghiệm pháp Coombs gián tiếp.
+Dùng men huỷ đạm.

3.3. Phương pháp hiệu giá kháng thể miễn dịch kháng A và kháng B bằng biện pháp Coombs gián tiếp: huyết thanh xét nghiệm đã được ức chế kháng thể tự nhiên hệ ABO bằng chất Witebsky hoặc bằng cách đun nóng. Phương pháp tiến hành như sau:

- Trong mười ống nghiệm pha loãng huyết thanh cần xét nghiệm ở nồng độ 1/1,1/2,1/4...1/512 bằng dung dịch nước muối 0,9% (4 giọt huyết thanh xét nghiệm với 4 giọt dung dịch nước muối 0,9%).

- Cho thêm vào mỗi ống 2 giọt dung dịch hồng cầu 5% (nhóm A hay B hồng cầu đã rửa 3 lần pha loãng với dung dịch nước muối 0,9%)

- Quay ly tâm lần thứ nhất 10 ống xem có kháng thể tự nhiên còn lại không (thường không quá 1/4). 

- Lấy những ống không ngưng kết để vào thùng cách thuỷ 37oC/1 giờ, đem quay ly tâm 2000 vòng/ phút. Rồi xem hiện tượng ngưng kết. Nếu thấy ngưng kết, chứng tỏ có kháng thể miễn dịch loại đủ. 

- Lại lấy những ống không ngưng kết đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/ phút/3 phút. Hút hết nước ở trên, rồi rửa hồng cầu 3 lần bằng dung dịch nước muối 0,9%.Sau lần rửa cuối cùng thì hút hết nước ở phía trên ra, rồi cho vào mỗi ống 2 giọt huyết thanh Coombs, lắc đều hồng cầu ở kháng huyết thanh, đem quay ly tâm 1000 vòng/ phút/1 phút. Rồi xem hiện tượng ngưng kết. Hiện tượng ngưng kết ở nghiệm pháp Coombs chứng tỏ sự có mặt của kháng thể miễn dịch loại thiếu (type incomplet).

3.4. Phương pháp dùng men huỷ đạm: để tìm hiểu kháng thể miễn dịch chống A và B khi hồng cầu đã được sử lý bằng men huỷ đạm, rồi cho tiếp xúc với kháng thể miễn dịch loại thiếu kháng A và kháng B, sẽ xuất hiện hiện tượng ngưng kết hồng cầu tương ứng.
- Phương pháp tiến hành: chuẩn bị tức thì dung dịch papain và khối hồng cầu rửa(A và B). Trong một số ống nghiệm cho: khối hồng cầu 0,5 ml; dung dịch papain 0,5 ml.

- Lắc đều rồi để vào thùng cách thuỷ 37oC, thời gian tuỳ từng loại papain mà hãng sản xuất qui định khác nhau.

- Rửa hồng cầu 3 lần bằng nước muối 0,9% để loại trừ hết papain( Rồi kiểm tra hồng cầu sau khi sử trí xem có bị ngưng kết không, nếu có ngưng kết phải xem lại các khâu trên).

- Pha dung dịch hồng cầu đã xử trí bằng Papain 3% trong dung dịch nước muối 0,9%.

- Huyết thanh xét nghiệm đã ức chế kháng thể tự nhiên đem pha loãng 1/1,1/2,1/4...1/512. Sau đó cho vào mỗi ống 2 giọt dung dịch hồng cầu đã xử trí bằng papain 3%.

- Lắc đều, để ở thùng cách thuỷ 37oC/ 1giờ.
- Xem hiện tượng ngưng kết ngay ở điều kiện ấm, không quay ly tâm.

- Kết quả: Hiện tượng ngưng kết hồng cầu xử trí bằng papain chứng tỏ có mặt của kháng thể miễn dịch loại thiếu.

Tìm hiểu kháng thể miễn dịch hệ ABO bằng nghiệm pháp Coombs gián tiếp và với hồng cầu xử trí bằng men, nên tiến hành cùng một lúc để đối chiếu với nhau cho thêm phần chính xác, thường kết quả giống nhau.