Cấy máu ngoại vi phân tích nhiễm sắc thể

1.      Nguyên lý

Các tế bào lympho máu ngoại vi khi tiếp xúc với chất gây phân bào (mitogene) có khả năng chuyển dạng thành tế bào non và phân chia. Lợi dụng khả năng đó, người ta nuôi cấy máu ngoại vi trong môi trường có chất kích thích phân bào và sau đó làm ngừng phân bào ở kỳ giữa - giai đoạn có hình dạng nhiễm sắc thể (NST) điển hình để làm tiêu bản quan sát NST. Phân tích NST tế bào máu ngoại vi cho phép chẩn đoán các hội chứng di truyền do bất thường NST, xác định NST giới của cá thể hoặc phát hiện một số tổn thương NST.

2.      Dụng cụ, hoá chất

2.1.      Hoá chất

1.      Heparin 5000 UI/ ml. Lọ 5 ml.

2.       Môi trường nuôi cấy tế bào: TC 199, RPMI hoặc môi trường MEM.

3.       Chất kích thích phân bào (PHA - Phytohémagglutinine).

4.       Huyết thanh nhóm máu AB.

5.       Dung dịch colcemid 0,004‰ (4 µg/ml)

6.    Chuẩn bị dung dịch nhược trương Hoặc dung dịch KC1 0,075M

Hoặc dung dịch huyết thanh AB pha loãng 1/6 trong nước cất

7. Chuẩn bị dung dịch	cố định
- Dung dịch Carnoy I
+ Cồn ethylìc 99° :	6 thể tích.
+ Acidacetic đặc :	1 thể tích.
+ Chorofoor :	3 thể tích.
- Dung dịch Carnoy II
- Cồn ethylic 99°	3 thể tích.
+ Acid acetic :	1 thể tích.

2.2.      Chuẩn bị dụng cụ

-      Bơm tiêm vô khuẩn.

-      Lọ cấy vô trùng có dung tích 15 - 30 ml.

-      Pipette các loại.

-      Ống ly tâm nhọn đáy dung tích 10 - 15ml.

-      Lam kính sạch.

-      Tủ ấm 37°C.

-      Tủ lạnh.

-      Máy ly tâm quay ngang.

-      Buồng cấy vô khuẩn.

-      Kính hiển vi.

3.       Quy trình kỹ thuật

3.1.      Nuôi cấy

-      Lấy máu tĩnh mạch vào bơm tiêm có tráng heparin, lượng máu lấy từ l-2ml.

-      Trong mỗi lọ cấy cho: 6,5 ml dung dịch nuôi cấy.

1 ml huyết thanh AB.

0,1 ml PHA.

0,4 ml máu.

Lắc nhẹ lọ cấy, để tủ ấm 37°c có 5% C0₂ (có thể đậy nút lọ cấy và để tủ ấm thưòng 37°C) trong thời gian 72 giờ, hàng ngày lắc nhẹ 1-2 lần.

Sau 72 giờ ủ ở tủ ấm, cho vào mỗi lọ cấy 0,1 ml dung dịch colcemid 0,004‰ lắc đều, đặt lại tủ ấm tiếp 2 giờ.

3.2.       Làm tiêu bản NST

3.2.1.         Nhược trương

-     Chuyển toàn bộ hỗn dịch ở lọ cấy sau khi ủ 2 giờ với colcemid vào ống ly tâm nhọn đáy, ly tâm ở máy ly tâm ngang 5 phút X 1000 vòng/ phút.

-     Sau ly tâm, hút bỏ phần dịch trong ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 3 mm).

-     Cho thêm vào ống ly tâm 8 ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37°C trước, 0,lml dung dịch EDTA 40 mg/ml, trộn đều và đặt lại vào tủ ấm 37°c trong thời gian 10-12 phút.

3.2.2.         Cố định

-     Lần 1: Sau khi ủ với dung dịch nhược trương, lấy ống ly tâm ra, cho thêm vào mỗi ống 0,2ml dung dịch Carnoy II, dùng pipette Pasteur trộn đểu, rồi lại ly tâm lấy cặn như trên, sau khi hút bỏ dung dịch trong ở phía trên, cho thêm vào mỗi ống 5-7 ml dung dịch Carnoy I, trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 15 phút.

-     Lần 2: Sau 15 phút lại ly tâm và hút bỏ phần trên, thêm vào mỗi ồng 5-7ml dung dịch Carnoy II, dùng pipette Pasteur trộn đều, để ỏ nhiệt độ phòng 10 phút.

3.2.3.        Nhỏ tiêu bản

-     Các phiến kính sạch, rửa qua với nước cất, để trên giá lam và giá lam được đặt trong ngăn đá tủ lạnh khoảng 10-15 phút, sau đó lấy ra để phang trên giấy thấm.

-     Các ống ly tâm sau 10 phút ủ vái dung dịch Carnoy II, được ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, lấy ra hút bỏ dung dịch trong trên. Dùng pipette Pasteur trộn đều cặn tế bào và lấy hỗn dịch cặn này nhỏ lên các phiến kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản, để đầu pipette cao hơn mặt phiến kính từ 10-20 cm.

3.2.4.        Để tiêu bản khô tự nhiên và tiển hành nhuộm Giemsa hoặc các kỹ thuật nhuộm khác

Nhuộm Giemsa:

-      Pha Giemsa tỷ lệ 1/10 trong đệm có pH - 6,8.

-      Đánh dấu tiêu bản và đặt vào bể nhuộm 10 phút

-      Rửa bằng nước máy và để khô, đọc kết quả.

3.3.       Phân tích kết quả

-     Soi tiêu bản sau khi được nhuộm với các kỹ thuật nhuộm Giemsa hoặc nhuộm băng dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 10 để tìm cụm NST dàn đều, chuyển sang vật kính X 100 để phân tích chi tiết.

-      Đếm số lượng từng cụm NST.

-      Tạm xếp công thức NST.

-      Chụp ảnh, làm ảnh NST.

-      Cắt NST rời từng chiếc và xếp theo danh pháp quốc tế.

-     Đánh giá các bất thường nếu có: cần phân tích đủ số lượng cụm NST vi nhiều khi bệnh nhân có dạng khảm NST.

4.      Các yếu tố ảnh hưởng

4.1.       Cấy không kết quả do tế bào không phân chia

-      Tủ ấm không đảm bảo nhiệt độ

-      Môi trường nuôi cấy: pH quá kiềm hay acid, nhiễm trùng, quá hạn

-      PHA không đảm bảo chất lượng

4.2.       Tế bào phân chia nhưng hình ảnh cụm NST xấu

-      pH của môi trường không phù hợp

-      Nhiệt độ tủ ấm không ổn định

-      Các dung dịch sử dụng khi chuẩn bị tiêu bản không đúng quy cách.

-      Tiến hành sai kỹ thuật.