Kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán

1. Môi trường 

1.1. Thạch Mueller - Hinton 

Môi trường phải là chuẩn hoá cao, giúp các vi khuẩn gây bệnh thông thường có thể mọc tốt. 

Có rất nhiều loại môi trường nhưng thạch Mueller - Hinton là thạch tốt nhất để làm thử nghiệm kháng sinh đồ vì: 

- Có đầy đủ các yếu tố giúp cho hầu hết các vi khuẩn gây bệnh có thể phát triển được. 

- ức chế thấp với sulfonamide, trimethoprim, tetracyclin. 

- Chất lượng môi trường ổn định từ mẻ này đến mẻ khác. 

- Đã được tiến hành nghiên cứu với số lượng lớn. Nếu môi trường không thích hợp, nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn kém phát triển thì vòng vô khuẩn sẽ lớn dẫn đến kết quả sai. 

1.2. Các yếu tố cần thiết để vi khuẩn phát triển 

Một số vi khuẩn cần thêm 5% máu cừu hoặc thỏ thì mới phát triển được như các loại liên cầu, phế cầu...). 

Tuy nhiên ở môi trường có máu thì vòng vô khuấn sẽ nhỏ lại như khoanh giấy của oxacillin, methicillin (nhỏ 2-3 mm), vòng vô khuẩn to ra ở xung quanh khoanh giấy sulfonamide và trimethoprim 

Một số vi khuẩn cần thêm các yếu tố bổ trợ để phát triển như vitamin, yếu tố X, V để phát triển (H. influenzae). 

1.3. Thymidine hoặc Thymine 

- Môi trường có chứa số lượng quá lớn thymidine hoặc thymine có thể dẫn đến việc ức chế sulfonamide, trimethoprim làm cho vòng vô khuẩn nhỏ hơn, thậm chí không có vòng vô khuẩn, dẫn đến kết quả sai. 

- Thêm thymidine phosphorylase hoặc máu cừu bị ly giải có thể làm tăng rõ ràng vòng vô khuẩn của sulfonamide và trimethoprim khi thử với đa số các loại vi khuẩn gây bệnh (trừ Enterococci). Vì vậy, nên sử dụng chủng mẫu Enterococcus faecalis ATCC 29213 để kiểm tra chất lượng của môi trường có thêm máu cừu hoặc thỏ. 

- Thạch Mueller-Hinton có chứa sẵn một lượng vừa đủ thyamine tự do. 

1.4. Các cation 

- Lượng ion Mg++ và Ca++ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của tetracycline và aminoglycoside. Các ion này có hàm lượng khác nhau trong mỗi hãng sản xuất khác nhau và trong các lô môi trường khác nhau. 

- Vì vậy, cần phải tiến hành thử nghiệm giám sát chất lượng môi trường khi có mẻ môi trường mới bằng chủng mẫu p. aeruginosa ATCC 27853. 

1.5. Độ pH 

- Độ pH nên khoảng 7,2 - 7,4 tại nhiệt độ phòng, khi đổ môi trường mỗi mẻ thạch cần được kiểm tra pH, pH có ổn định thì kết quả kháng sinh đồ mới chính xác. 

- Độ pH có ảnh hưởng tới tốc độ phát triển của vi khuẩn và tác động lên vi khuẩn gây ảnh hưởng đến kết quả kháng sinh đồ. 

- Độ pH còn ảnh hưởng tới hoạt động của kháng sinh: 

- pH thấp làm hoạt động kháng sinh giảm và vòng vô khuẩn nhỏ như đối với aminoglycoside, clindamycin, erythromycin, quynolon. 

- pH thấp làm hoạt động kháng sinh tăng và vòng vô khuẩn rộng như tetracycline, nitrofuratoin, novobiocin, methicillin, oxaciclin. 

- Khi hấp lò ở nhiệt độ cao, thời gian kéo dài sẽ làm pH giảm, môi trường sẽ có màu nâu xám. 

1.6. Độ ẩm của thạch 

Trước khi ria cấy vi khuẩn vào môi trường phải làm khô mặt thạch vì mặt thạch ướt vi khuẩn sẽ mọc dày làm thu hẹp vòng ức chế. 

Làm khô mặt thạch bằng cách để tủ ấm khoảng 15 - 30 phút, không để lâu hơn vì sẽ làm quá khô mặt thạch, vi khuẩn khó mọc và ảnh hưởng đến sự khuếch tán kháng sinh, làm vòng vô khuẩn nhỏ lại. 

1.7. Độ dày của thạch 

Độ dày trung bình của thạch là 4 + 0.5 mm, không nên quá dày hoặc quá mỏng sẽ làm kháng sinh khuếch tán nhiều hơn theo chiều sâu hoặc chiều ngang làm sai kêt quả. 

1.8. Các môi trường đặc biệt 

- S. aureus để thử Oxacillin. 

- Thạch Mueler Hinton có máu cho S. pneumoniae. 

- Thạch Mueler Hinton có yếu tố X và V cho Haemophylus. 

2. Huyền dịch vi khuẩn dùng trong thử nghiệm 

        Huyền dịch vị khuẩn dùng trong thử nghiệm là 108 vi khuẩn/ ml. So sánh với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 (pha bằng BaS04) có nồng độ tương đương với nồng độ 108 vi khuẩn/ml. 

Có hai phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: 

- Chọn trực tiếp khuẩn lạc: chủng vi khuẩn dùng trong phương pháp này phải thuần, vừa được nuôi cấy qua đêm. Nhặt 3-5 khuẩn lạc cùng loại trên môi tr­ường nuôi cấy thuần, qua đêm. Hoà đều trong 3 - 5 ml nước muối sinh lý. Lắc đều bằng tay hoặc máy lắc. So sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5, điều chỉnh độ đục bằng cách thêm nước muối sinh lý hoặc vi khuẩn. 

- Nuôi cấy trong canh thang: Nhặt 3-5 khuẩn lạc cùng loại trên môi trường nuôi cấy thuần. Hoà đều trong 4 - 5 ml canh thang thích hợp (tryptic soy broth, BHI). ủ ấm canh thang ở 35°C cho đến khi so sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 (khoảng sau 2-6 giờ). Điều chỉnh độ đục bằng cách thêm canh thang hoặc vi khuẩn.

3. Ria vi khuẩn 

       Trong vòng 15 phút sau khi điều chỉnh độ đục, dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn, xoay tròn tăm bông vài lần rồi vắt bớt nước bằng cách ép tăm bông vào thành ống. Dùng tăm bông vạch ngang 2 lần vuông góc trên mặt đĩa thạch. Sau đó ria tăm bông đều lên mặt thạch bằng cách mỗi lần ria xoay đĩa 60°. 

4. Khoanh giấy kháng sinh 

    Bảo quản kháng sinh: mỗi khoanh giấy kháng sinh được thấm một hàm lượng nhất định tính bằng µg/ml. Mỗi kháng sinh có độ bền khác nhau. Nhiệt độ và độ ẩm cao dễ làm bất hoạt kháng sinh nhất là kháng sinh họ β-lactam. Vì vậy, đối với kháng sinh sử dụng hàng ngày phải được bảo quản ở 2-8°C (ngăn dưới tủ lạnh). Các kháng sinh bảo quản lâu hơn phải bảo quản ở - 20°C (ngăn đá). 

     Chọn kháng sinh: mỗi loại kháng sinh có phổ tác dụng nhất định với từng loại vi khuẩn. Vì vậy mỗi loại vi khuẩn sẽ được thử với một số loại kháng sinh nhất định. Các kháng sinh này được chọn theo tài liệu hướng dẫn của CLSI (Bảng hướng dẫn lựa chọn kháng sinh). 

      Đặt kháng sinh: dùng kim đầu nhọn đặt nhẹ khoanh giấy cho tiếp xúc đều trên mặt thạch. Khoảng cách giữa các khoanh giấy là 24 mm, cách rìa đĩa thạch 15 mm. Như vậy đĩa thạch đường kính 10 cm có thể đặt 5-6 khoanh giấy kháng sinh. 

5. Điều kiện ủ ấm 

Nhiệt độ quá cao làm đường kính vòng vô khuẩn sẽ nhỏ lại. 

Điều kiện ủ ấm cho các vi khuẩn thông thường là 35-37°C/ khí trường thường/18-20 giờ. 

Đặc biệt: 

- Campylobacter ủ ở 42°C. 

- S. aureus thử độ nhạy cảm với oxacillin ủ ở 30°C, 24 giờ. 

- Enterococci thử độ nhạy cảm với vancomycin cần ủ 24 giờ. 

- Yersinia pestis cần ủ 25°c. 

- Haemophylus cần ủ trong điều kiện có 5-7% CO2. 

6. Đọc và diễn giải kết quả 

     Đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh, đường kính được tính ra milimet. Đường kính này đựơc chia thành các mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng chuấn theo hướng dẫn của tài liệu CLSI. 

     Kết quả kháng sinh đồ được chia thành các loại A, B, C, U, O để ưu tiên chọn lọc trong điều trị (Bảng diễn giải đường kính vùng ức chế) 

Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 

7. Kiểm tra chất lượng 

1.1. Mục đích 

- Giám sát tính chính xác của thử nghiệm kháng sinh đồ. 

- Giám sát các vật liệu, môi trường sử dụng trong thử nghiệm. 

- Giám sát kỹ thuật tiến hành và đọc kết quả của người xét nghiệm. 

1.2. Chọn chủng kiểm tra chất lượng 

Các chủng kiểm tra chất lượng là chủng mẫu ATCC có độ nhạy cảm nhất định với các kháng sinh (độ nhạy này là một hằng số không đổi). 

- E. coli ATCC 25922 (Kiểm tra hàng ngày hoặc hàng tuần). 

- S. aureus ATCC 25923 (Kiểm tra hàng ngày hoặc hàng tuần). 

- p. aeruginosa ATCC 27853 (Kiểm tra mỗi khi có mẻ môi trường mới) 

- E. faecalis ATCC 29212 (Kiểm tra kháng sinh đồ có thêm máu). 

- S. pneumoniae ATCC 49619 (Kiểm tra song song với chủng phế cầu). 

- H. influenzae ATCC 49247 (Kiểm tra song song với chủng H. influenzae). 

7.3. Đánh giá chất lượng 

     Để đánh giá tính chính xác của thử nghiệm, tiến hành thử kháng sinh đồ của chủng mới phân lập được song song với chủng mẫu ATCC theo ngày hoặc theo tuần trong cùng một môi trường và điều kiện thử nghiệm. 

    Khi đọc kết quả nếu đường kính vòng vô khuẩn của chủng mẫu ATCC ở trong giới hạn cho phép có nghĩa là kỹ thuật thực hiện chính xác (Bảng kiểm tra chất lượng). Nếu ngoài giới hạn cho phép ta phải kiểm tra lại xem khâu sai sót có thể do kỹ thuật tiến hành, do môi trường, do người thực hiện để sửa chữa. Đối với thử nghiệm so sánh hàng ngày sai sót cho phép là 1/20, so sánh hàng tuần sai sót cho phép là 1/30. 

    Bảo quản chủng chuẩn quốc tế ở - 20°C, cấy chuyển hàng tháng. Chủng sử dụng hàng tuần giữ ở thạch nghiêng, chuyển ra đĩa trước khi sử dụng. 

8. Những sai sót thường gặp 

- Đọc kết quả đường kính vô khuẩn sai. 

- Chủng bị nhiễm bẩn hoặc nhầm lẫn thành chủng khác. 

- Nồng độ vi khuẩn pha vào quá đặc hoặc quá loãng. 

- Độ đục Mac Faland 0.5 không chuẩn. 

- Điều kiện ủ ấm về nhiệt độ, thời gian, khí trường không đúng quy định. 

- Môi trường không chuẩn, quá hạn sử dụng, hấp môi trường sai. 

- Bảo quản kháng sinh không tốt ảnh hưởng đến hoạt lực. 

Nên tiến hành thử nghiệm lại hoặc kiểm tra lại. 

9. Giới hạn của phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 

   Phương pháp này là chuẩn hoá cho các vi khuẩn ưa khí, dễ mọc như Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Enterobacteriaceae, v.choierae, p.aeruginosa, Acinetobacter spp. 

  Là phương pháp cải tiến cho các vi khuẩn khó mọc như Heamophilus, Streptococci, N. gonorrhoeae, S. pneumoniae. 

 Đối với các vi khuẩn khác như Campylobacter, Bacillus, Corynebacterium spp. không nên thử phương pháp này vì đòi hỏi phải có môi trường, khí trường, thời gian ủ đặc biệt. 

Kết quả có thể nhầm khi thử một số kháng sinh đối với một số vi khuẩn đặc biệt: 

- Salmonella và Shigella khi thử với cephalosporin thế hệ 1, 2 và aminoglycoside. 

- S. aureus kháng methicillin khi thử với các kháng sinh nhóm P-lactam (trừ oxacillin). 

- Enterococci khi thử với cephalosporin, aminoglycoside, clindamycin, co - trimoxazol. 

- Listeria khi thử với cephalosporin. 

Khoanh giấy kháng sinh khuếch tán chi là phương pháp thử nghiệm in vitro nên có những trường hợp kết quả là nhạv cảm nhưng thực tế điều trị lại không có tác dụng do phụ thuộc vào một số yếu tố: 

- Kháng sinh: đường vào, liều lượng, thời gian và dược lực học. 

- Vi khuẩn 

- Người bệnh 

10. Những vấn đề kháng kháng sinh cần chú ý 

(1). S. aureus kháng methicillin (MRSA). S. aureus giảm nhạy cảm với vancomycin (VRSA). 

(2). Enterococci kháng penicillin, ampicillin. Enterococci kháng vancomycin (VRE). 

(3) . E. coli, Klebsiella sinh ß-lactamase phổ rộns (ESBL) kháng cephalosporin thế hệ 3,4. 

(4) . Salmonella, Shigella kháng quinoion. 

(5) . S. pneumoniae kháng penicillin. 

(6) . Neisseria gonorrhoeae kháng penicillin. 

(7) . H. influenzae sinh ß-lactamase. 

(8) . Moraxella catarrhalis sinh ß-lactamase.

Bảng lựa chọn kháng sinh thử nghiêm và diễn giải đường kính vùng ức chế của E.coli và trực khuẩn đường ruột khác

TT	Kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Ký hiêu Whonet	Đường kính S,I,R	Ghi chú
1.	Ampiciline	10	AM	AMP	14-16
2.	Piperacillin	100	PIP	PIP	18-20
3.	Ertapenem	10	ETP	ETP	16-18
4.	Imipenem	10	IMP	IMP	14-15
5.	Meropenem	10	MEM	MEM	14-15
6.	Cephalothine	30	CF	CEF	15-17
7.	Cefuroxime	30	CXM	CXA	15-17
8.	Ceftazidime	30	CAZ	CAZ	18-20
9.	Ceftriaxone	30	CRO	CRO	20-22
10.	Cefotaxime	30	CTX	CTX	23-25
11.	Cefoxitin	30	FOX	FOX	15-17
12.	Cefepime	30	FEP	FEP	15-17
13.	Amo+A.clavula	20/10	AMC	AMC	14-17
14.	Ampi + Sulbact	20	'SAM	SAM	12-14
15.	Piper+Tazobact	10	TZP	TZP	18-20
16.	Gentamicine	10	GM	GEN	13-14
17.	Tobramicine	10	TM	TOB	13-14
18.	Amikacin	30	AN	AMK	15-16
19.	Ciprofloxacin	5	CIP	CIP	15-21
20.	Levofloxacin	5	LVX	LYX	13-17
21.	Co-trimoxazol	25	SXT	SXT	11-15
22.	Fosmycin	50	FOS	FOS	13-15

-  Trong quá trình điều trị một số vi khuẩn mới xuất hiện đề kháng. vì vậy lúc đầu thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn có thể nhạy cảm sẽ trở thành đề kháng sau 3-4 ngày điều trị. 

- Thường gặp ở các vi khuẩn như Enterobacter, Citrobacter, Serratia khi thử với Cephalosporin thế hệ 3. 

- p. aeruginosa khi thử với tất cả các kháng sinh 

- S. aureus khi thử với các kháng sinh nhóm quinolon. 

- Trong những trường hợp này nên tiến hành lại thử nghiệm kháng sinh đồ.

Bảng lựa chọn kháng sinh nghiệm và diễn giải đường kính vùng ức chế của p.aeruginosa và Pseudomonas spp. khác

TT	Kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Ký hiêu Whonet	Đường kính S,I,R	Ghi chú
1.	Piperacillin	100	PIP	PIP	≥ 18
2.	Ticarcillin	75	TIC	TIC	≥ 15
3.	Aztreonam	30	ATM	ATM	16-21
4.	Imipenem	10	IMP	IMP	14-15
5.	Meropenem	10	MEM	MEM	14-15
6.	Ceftazidime	30	CAZ	CAZ	15-17
7.	Cefepime	30	FEP	FEP	15-17
8.	Tica+A.clavulanic	75/10	TCC	TCC	≥ 15
9.	Piper+T azobactam	10	TZP	TZP	≥ 18
10.	Gentamycine	10	GM	GEN	13-14
11.	Tobramycine	10	TM	TOB	13-14
12.	Amikacin	30	AN	AMK	15-16
13.	Ciprofloxacin	5	CIP	CIP	16-20
14.	Levofloxacin	5	LVX	LVX	14-16
15.	Colistin	10	cs	COL	≥ 11
16.	Polymixin	300 IU	PB	POL	≥ 12

Bảng  Lựa chọn kháng sinh thử nghiêm và diễn giải kính vùng ức chế của Acineiobacter baumannii

TT	Kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Ký hiệu Whonet	Đường kính S,I,R	Ghi chú
1.	Piperacillin	100	PIP	PIP	18-20
2.	Imipenem	10	IMP	IMP	14-15
3.	Meropenem	10	MEM	MEM	14-15
4.	Ceftazidime	30	CAZ	CAZ	15-17
5.	Ceftriaxone	30	CRO	CRO	14-20
6.	Cefotaxime	30	CTX	CTX	15-22

	Kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Ký kiêu Whonet	. Đưởng kính S,I,R	Ghi chú
	Cefepime	30	FEP	FEP	15-17
	Ampi + Sulbact	20	SAM	SAM	12-14
	T ica+A.clavulanic	75/10	- TCC	TCC	15-19
	Piper+T azobactam	10	TZP	TZP	18-20
	Gentamycine	10	GM	GEN	13-14
	Tobramycine	10	TM	TOB	13-14
	Amikacin	30	AN	AMK	15-16
	Ciprofloxacin	5	CIP	CĨP	16-20
	Levofloxacin	5	LVX	LVX	14-16
	Doxycycllin	30	DO	DOX	10-12
	Minocyclin	30	MNO	MNO	13-15
	Co-trimoxazol	25	SXT	SXT	11-15

 

Bảng lựa chọn kháng sinh thử nghiêm và diễn giải đường tính vùng ức chế của Staphylococcus aureus

TT	Kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Ký hiệu Whonet	Đường kính S,I,R	Ghi chú
1.	Penicillin	10	P	PEN	≥ 29
2.	Cefoxitin	30	FOX	FOX	≥ 22
3.	Erythromycine	15	E	ERY	14-22
4.	Azithromycin	15	AZM	AZM	14-17
5.	Clindamycin	2	CM	CLI	15-20
6.	Vancomycin	30	VA	VAN	MIC
7.	Gentamycine	10	GM	GEN	13-14
8.	Ciprofloxacin	5	CIP	CIP	16-20
9.	Levofloxacin	5	LVX	LVX	14-16 .
10.	Chlorampheni col	30	CL	CHL	13-17
11.	Tetracycline	30	TE	TCY	15-18
12.	Co-trimoxazol	25	SXT	SXT	11-15
13.	Lizonalid	30	LZD	LNZ	≥ 21

 Lựa chọn kháng sinh thử nghiệm và diễn mải đường kính vùng ức chế của Enterococci

TT	Kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Ký hiệu Whonet	Đường kính S,I,R	Ghi chú
1.	Penicillin	10	p	PEN	≥29
2.	Erythromycine	15	E	ERY	14-22
3.	Vancomycin	30	VA	VAN	15-16
4.	Ciprofloxacin	5	CIP	CIP	16-20
5.	Levofloxacin	5	LVX	LVX	14-16	Nước tiểu
6.	Chloramphenicol	30	CL	CHL	13-17
7.	Doxycycllin	30	DO	DOX	13-15
8.	Minocyclin	30	MNO	MNO	15-18
9.	Lizonalid	30	LZD	LNZ	21-22
10.	Nitrofuratoin	300	FT	NIT	15-16	Nước tiểu
11.	Fosmycin	50	FOS	FOS	13-15

Bảng kiểm tra chất lượng với chủng mẫu E. coli ATCC 25922

TT	Tên kháng sinh	Nồng độ (µg)	Ký hiệu	Đường kính S,I,R__
1.	Ampicilline	10	AM	16-22
2.	Ciprofloxacine	5	CIP	30-40
3.	Amoxicillin+a.clavulanic	20/10	AMC	19- 25
4.	Gentamycine	10	GM	19-26
5.	Co- trimoxazol	1.25/ 23.75	SXT	24-32
6.	Chloramphenicol	30	CL	21 - 27
7.	Ceftriaxone	30	CRO	29-35

Bảng kiểm tra chất lượng với chủng mẫu P.aeruginosa ATCC 27853

TT	Tên kháng sinh	Nồng đô (µg)	Ký hiêu	Đường kính S,I, R
1	Ceftriaxone	30	CRO	17-23
2	Gentamycine	10	GM	16 - 21
3	Ciprofloxacine	5	CIP	25-33

Bảng kiểm tra chất lương vởi chủng mẫu S.aureus ATCC 25923

TT	Tên kháng sinh	Nồng độ (ßg)	Ký hiệu	Đường kính S, I, R
1	Penicilline	10 units	P	26-37
2	Ampicilline	10	AM	27-35
3	Amoxycillin+A.clavulanic	20/10	AMC	28 - 36
4	Oxacilline	1	OX1	18-24
5	Ceftriaxone	30	CRO	22-28
6	Erythomycine	15	E	22 - 30
7	Vancomycine	30	VA	17-21
8	Gentamycine	10	GM	19-27
9	Ciprofloxacine	5	CIP	22 - 30
10	Chloramphenicol	30	C	19 - 26
11	Co- trimoxazol	1.25/ 23.75	SXT	24-32