Nuôi cấy, phân lập, định danh Salmonella

    1.  Giới thiệu

Salmonella là những trực khuẩn Gram (-), nói chung di động, thuộc họ Enterobacteriaceae (họ các trực khuẩn đường ruột) nên có các tính chất chung của họ này. Có 2 loại Salmonella thường gây bệnh ở người:

Salmonella gây bệnh thương hàn: S.typhi, S.paratyphi A, S.paratyphi B, S.paratyphi C. Các Salmonella này chỉ gây bệnh cho người.

Salmonella gây nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn: S. enterìiidis, S. typhimurium... Các Salmonella này vừa gây bệnh cho người, vừa gây bệnh cho động vật.

Từ năm 1995, ở Việt Nam đã xuất hiện nhiều ổ dịch thương hàn do các chủng S.typhi đa kháng kháng sinh như chloramphenicol, tetracyclin ampicilin và co-trimoxazol làm cho việc điều trị hết sức khó khăn.

2. Hình thể và tính chất bắt màu

Salmonella là những trực khuẩn bắt màu Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1 µm. Vi khuẩn di động, có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullomm), không sinh nha bào, không có vỏ.

 

Salmonella trên lam nhuộm

3
3.  Nuôi cấy, phân lâp

3.1.            Môi trường nuôi cấy

- Canh thang selemite: là môi trường tăng sinh cho Salmonella.

- Môi trường Mac Conkey là môi trường phân lập ít chọn lọc cho các vi khuẩn họ đường ruột Enterobacteriaceae nên có thể sử dụng để cấy phân

+ Muối mật và thuốc nhuộm (crystal violet) có tác dụng ức chế các vi khuẩn Gram (+) và một số vi khuẩn Gram (-) khó mọc.

+ Ức chế sự lan của ProteuS.

+ Sự lên men đường lactose sẽ được phát hiện bằng chi thị màu đỏ trung tính khi pH < 6,8. Vi khuẩn lên men đường lactose khuẩn lạc sẽ có màu đỏ, lên men đường lactose chậm sẽ có màu hồng.

- DCA (Desoxycholate-Citrate-Agar), SS (Salmonella-Shigella) là môi trường phân lập chọn lọc cao cho các vi khuẩn đường ruột, ưu tiên cho Salmonella và Shigella phát triển nên thường được sử dụng để cấy phân:

+ Muối mật (sodium desoxycholate) hoặc thuốc nhuộm với nồng độ cao có tác dụng ức chế các vi khuẩn Gram (+) và một số vi khuẩn Gram (-) khó mọc, ưu tiên cho Salmonella và Shigella phát triến.

+ Ức chế sự lan của ProteuS.

+ Sự lên men đường được phát hiện bằng chi thị màu trung tính.

+ Sodium thiosulfat là nguồn sulfur, vi khuẩn sinh H2S sẽ có sắc tố đen.

3.2.           Điều kiện ủ ấm

- Khí trường: Salmonella là vi khuẩn hiếu kỵ khí tuỳ tiện

- Nhiệt độ: có thể phát triển ở nhiệt độ 6-42°C. Nhiệt độ tối ưu là 37°c.

- Thời gian ủ ấm: 18-24 giờ.

3.3.  Hình thái khuẩn lạc

- Trên môi trường lỏng, sau 5-6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đục nhẹ và sau 18 giờ môi trường đục đều.

- Trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, không màu hoặc màu trắng xám.

- Trên môi trường Mac Conkey: khuẩn lạc trong suốt, hơi hồng do không lên men lactose.

- Trên môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA, SS: khuẩn lạc trong suốt, hơi hồng do không lên men lactose. Nếu sinh H2S ở giữa khuẩn lạc có núm đen.

 

Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường SS à Macconkey 

3.4. Tính chất sinh vật học chính

Salmoneila thuộc họ các trực khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có các tính chất chung của họ này là oxydase (-), glucose (+).

 

Salmonella sinh H2S (ống số 3) trên môi trường Kligler

Ngoài ra còn có một sổ tính chất đặc trưng cho loài như:

- Lên men đường manit, sorbitol (+)

- Không lên men đường lactose, sucrose, salicin, inositol (-)

- Phản ứng (+): RM, citrate simmons (trừ S. typhi), di động, sinh hơi (trừ S. typhi), H2S (trừ S. paratyphi A), lysindecacboxylase (LDC) (trừ S. paratyphi A).

- Phản ứng (-): YP, ONPG, indol, urease, lipase, deoxyribonuclease (GDC).

Trên môi trường Kligler: phần tù màu vàng do lên men glucose, có thể đen do sinh H2S (trừ S. paratyphi A, S. typhi có vết đen). Phần nghiêng có màu đỏ do không lên men lactose.

Tuy nhiên, không phải bất kỳ Salmonella nào cũng có đầy đủ những tính chất trên.

Bảng 1. Công thức kháng nguyên của một sổ tỵp huyết thanh Salmonella theo sơ đồ của Kauffman và White

Nhóm	Serotyp	Kháng nguyên thân (O)	Kháng nguyên lông (M)
			Pha 1	Pha 2
A	Salmonella group A	2
	Salmonella paratyphi A	1 , 2 , 12	a
B	Salmonella group B	4
	Salmonella paratyphi B	1,4,5,12	b	1,2
	Salmonella typhimurium	1,4,5,12	i	1,2
Cl	Salmonella group Cl	6,7
	Salmonella paratyphi C	6,7, Vi	c	1,5
	Salmonella choleraesuis	6,7	c	1,5
C2	Salmonella group C2	8
D	Salmonella group D	9
	Salmonella typhi	9,12 , Vi	c, d
	Salmonella enteritidis	1,9,12	m
E	Salmonella group E	3, 10, 15, 19

 4. Chẩn đoán xác định

Các Salmonella có hai loại kháng nguyên chính là kháng nguyên thân (kháng nguyên O) và kháng nguyên lông (kháng nguyên H), Một số chủng còn có kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên Yi). Dựa trên kháng nguyên o, Vi và H, Kauffman và White đã chia loài Salmonella thành nhiều typ huyết thanh khác nhau. Hiện nay người ta đã phát hiện ra trên 2.200 typ huyết thanh.

Để khẳng định typ huyết thanh của Salmonella phải tiến hành ngưng kết Salmonella với các kháng huyết thanh đa giá, đơn giá.

5. Chẩn đoán phân biệt

- Citrobacter spp.

+ LDH(-).

+ H2S (-).

+ Indol (+).

+ Không ngưng kết với kháng huyết thanh Salmonella.

- Proteus spp.

+ Không ngưng kết với kháng huyết thanh Salmonella.