Quy trình đếm tế bào T-CD4 trên máy FACSCALIBUR

Hệ thống máy FasCalibur bao gồm 1 hoặc 2 đèn laser, các các kênh thu tín hiệu FSC, SSC và 3 hoặc 4 kênh thu tín hiệu huỳnh quang (FL1 – FL4). Trong hệ thống máy này ngoài việc đếm tế bào lympho T-CD4, máy còn có thể thực hiện các ứng dụng khác trong chẩn đoán lâm sàng và trong nghiên cứu.

Hãng BD thiết kế phần mềm chuyên dụng Multiset và bộ       sinh phẩm

Tritest  CD3   FITC/CD4   PE/CD45   PerCP  hoặc  Multitest  CD3   FITC/CD8

PE/CD45 PerCP/CD4 APC cùng với ống TruCount có chứa các hạt bi với số lượng xác định phục vụ chuyên biệt cho việc đếm số lượng tuyệt đối tế bào lympho T-CD4. Bên cạnh đó, máy cũng có thể chạy với chế độ tự điều chỉnh với sinh phẩm mở và kết hợp với giá trị công thức máu để thu nhận kết quả về phần trăm, số lượng tuyệt đối tế bào lympho T-CD4. Sau thời gian xử lý mẫu khoảng

45 phút, máy có thể thực hiện đọc kết quả với công suất 50-60 mẫu/giờ.

1. Thiết bị, hoá chất, bệnh phẩm

1.1.Thiết bị

- Máy đếm tế bào dòng chảy Facscalibur

- Pipette 20µl, 50µl, 200µl, 1000µl.

- Máy lắc votex.

- Tủ lạnh bảo quản sinh phẩm 2-8 độ C.

- Đồng hồ đếm ngược (count down timer).

1.2. Dụng cụ, hóa chất

- Kháng thể đơn dòng:

+ Tritest CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP: dùng đếm số lượng và phần trăm tế bào lympho T-CD4:                                                          340402 – BD

+ Multitest CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCp/CD45-APC: dùng xác định số lượng và phần trăm tế bào lympho T-CD4 và T-CD8:            340491 - BD

- Chuẩn máy BD Calibrite 3 màu FITC/PE/PerCP        340486 – BD

- Chuẩn máy 4 màu thêm APC                                      340487 – BD

- Dung dịch ly giải hồng cầu (Facs lysing Solution)       349202 – BD

- Ống TruCount                                                             340334 – BD

- Dịch chạy tạo dòng bao (sheath fluid)                         342003 – BD

- Dung dịch rửa máy 1 (FacsClean)                                340345-BD

- Dung dịch rửa máy 2 (FacsRinse)

- Dung dịch cố định mẫu (fixative)                                 338036-BD

- Đầu tip 200ul, 1000ul phù hợp với pipet

2. Bệnh phẩm: Theo hướng dẫn về quy định lấy mẫu bệnh phẩm.

3. Kỹ thuật tiến hành

3.1. Vận hành máy

- Khởi động máy: Tiến hành đầu mỗi ngày khi sử dụng máy

+ Thay bình nước thải, cho vào 150ml Javel 5%.

+ Bổ sung dung dịch chạy mẫu (khoảng 2/3 bình).

+ Đóng van áp suất.

+ Bật máy FACSCalibur, trước bật máy tính sau.

+ Đuổi bọt khí “Prime” 3-5 lần, sau đó để máy ở chế độ chờ “Standby”

- Chuẩn máy, chạy mỗi ngày đối với quy trình phân tích tự động:

+ Chuẩn bị ống A: 1ml sheathfluid + 1 giọt bi không gắn huỳnh quang – unlabeled bead ( + 1 giọt bi có gắn APC nếu là máy 4 màu), lắc đều bằng máy Vortex.

+ Ống B: 2ml sheathfluid + 1 giọt bi không gắn huỳnh quang + 1 giọt các loại bi có gắn huỳnh quang, lắc đều bằng máy Vortex.

+ Mở chương trình FascComp

+ Nhập các thông số lô của hộp Calibrite vào máy

+ Chọn chế độ Lyse/No wash

Biểu tượng phần mềm FacsComp trên màn hình máy tính

+ Chạy các ống A và B theo hướng dẫn trên phần mềm.

+ Ghi nhận kết quả, kết quả hiển thị dưới dạng đạt/không đạt (Pass/Fail) nếu tất cả các thông số đều báo đạt cho tiến hành chạy mẫu. Nếu không liên hệ kỹ sư để khắc phục sự cố

+ Tiến hành chuẩn điều kiện chạy mẫu (optimize settings) và lưu kết quả chuẩn, nếu thấy các quần thể phân tích chưa rõ ràng theo phân vùng của kháng thể sử dụng có thể điều chỉnh các thông số trên thanh công cụ cytometer và compensation.

+ Theo dõi tín hiệu PMT và vẽ biểu đồ Leveys Jenning nhằm theo dõi độ ổn định của đèn laser.

+ Khi cân chỉnh máy đạt yêu cầu, tiến hành nhuộm mẫu.

Kết quả chạy chuẩn máy được hiển thị tự động dưới dạng pass/fail (đạt/không đạt) cho tất cả các thông số. Chỉ tiến hành phân tích mẫu khi tất cả các thồn số đều đạt

3.2. Phân tích mẫu

- Xử lý mẫu:

+ Ghi mã số của mẫu bệnh phẩm lên ống TruCount

+ Thực hiện mẫu chứng nội (IQC) như một mẫu bệnh phẩm thông thường.

+ Hút vào mỗi ống mẫu 20ul kháng thể (Multitest/Tritest) cho vào mỗi ống mẫu.

  + Cho vào mỗi ống tương ứng 50ul mẫu máu, đậy nắp, lắc votex nhẹ.

+ Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Cho 450 µl dung dịch ly giải hồng cầu.

+ Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Phân tích mẫu bằng máy FacsCalibur bằng phần mềm MULTISET.

- Chạy mẫu:

+ Mở chương trình chạy mẫu “MULTISET” trong thư mục BD Applicatio hoặc nhấn vào biểu tượng trên màn hình máy tính.

Biểu tượng phần mềm MULTISET trên máy tính

Giao diện phần mềm Multiset

+ Nhập các thông số kỹ thuật trong mục Test Prefs, bao gồm các thông số:

loại sinh phẩm được sử dụng, lô hóa chất, số lượng hạt beads trên ống TruCount.

+ Chọn chế độ thu thập thông tin

+ Nhập chế độ báo cáo và lưu giữ thông tin:

Chế độ báo cáo mẫu phân tích, chế độ lưu giữ thông tin cũng được thiết lập và cho phép người sử dụng chọn đường dẫn

+ Sau khi chọn xong các chế độ nhấn accept và tiến hành chạy mẫu.
+ Đưa mẫu nội kiểm vào vị trí đặt mẫu nhập tên mẫu và nhấn “run tests” để chạy mẫu IQC

+ Đánh giá kết quả mẫu nội kiểm theo hướng dẫn của quy trình kiểm soát chất lượng, nếu đạt cho tiến hành chạy mẫu. Nếu không đạt tìm nguyên nhân và biện pháp khắc phục.

+ Nhập mã số mẫu kế tiếp cho mẫu vào và tiếp tục nhấn “Run tests”:

Hiển thị khoanh vùng tự động lympho bào trong quá trình

thu thập dữ liệu.

Khoanh vùng tế bào lympho T-CD4 và T-CD8. Vùng màu xanh lá

cây là vùng quần thể lympho T CD4, vùng màu tím là vùng lympho T CD8

+ Sau mỗi lần chạy, kết quả sẽ được tự động phân tích và in. Kiểm tra kết quả nếu có bất thường phải xử lý ngay (theo hướng dẫn lỗi phát sinh của BD).

- Rửa máy và tắt máy:

+ Cho ống dung dịch rửa máy 1 - “FacsClean” vào, chạy 5 phút (chế độ

+ Cho ống dung dịch rửa máy 2 - “FacsRinse” vào, chạy 5 phút (chế độ

+ Thay bằng ống nước cất, chạy 5 phút và giữ nguyên trên máy.

+ Chuyển sang chế độ standby.

+ Mở van áp lực và tắt máy.

4. Sự cố và cách khắc phục

Mẫu chạy quá nhanh: thông thường khi mẫu có hồng cầu non, không bị ly giải mẫu thường đọc rất nhanh (khoảng 3-5s). Khắc phục sự co bằng cách chuyển sang chế độ đọc theo thời gian. Vào mục Test Prefs trên góc màn hình chọn chuyển chế độ. Hoặc có thể để mẫu ở nhiệt độ phòng sau 24h rồi xử lý mẫu lại.

Mất áp lực khi chạy mẫu: thông thường ống tuýp bị nứt vỡ hoặc cổng hút mẫu bị hở sẽ làm mất áp lực,  mẫu sẽ không được hút lên, có hiện tượng trào dung dịch sheathfluid vào ống mẫu. Đèn chạy mẫu “Run” chuyển từ màu xanh lá cây xanh vàng. Khắc phục sự cố bằng cách kiểm tra lại ống mẫu xem có nứt mẫu hay không. Xử lý lại mẫu khi ống mẫu bị nứt vỡ. Nếu lỗi do cổng hút mẫu cần phải liên lạc với kỹ sư của hãng.

Số lượng bi chuẩn không được đếm đủ: (Could not acquire the BDIS- reference 500 bead events). Khắc phục sự cố: xem lại vị trí khoanh vùng hạt bi chuẩn, tăng ngưỡng (threshold) trong trường hợp có nhiều tín hiệu nhiễu.

Không thể khoanh vùng quần thể lympho: quần thể lympho và mono lẫn vào nhau và không thể khoanh vùng do tính toàn vẹn mẫu không đảm bảo. Khắc phục: mở rộng hình ảnh phân tích tiến hành lấy cổng bằng tay hoặc nếu thấy có hiện tượng quần thể CD3 âm và dương tính không thể phân tách thì cho lấy mẫu lại.

Vị trí các quần thể không nằm trong khoanh vùng mặc định: một số trường hợp tế bào có bất thường về biểu hiện các kháng nguyên bề mặt làm cho các tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ các kháng nguyên tương ứng bị lệch ra khỏi khoanh vùng mặc định của máy. Thường gặp khi chạy mẫu máu trẻ em, mẫu máu đã cố định, bệnh nhân dùng thuốc kháng ARV ... Ví dụ: đám quần thể âm tính tràn sang vùng dương tính CD4 (CD8), hoặc khi chạy mẫu kiểm tra chất lượng vùng lympho bào nằm ngoài vùng mặc định. Khắc phục bằng cách chỉnh tay khoanh vùng tự động, hoặc vào mục optimize settings đe chuấn và chạy lại mẫu.

Những lỗi về máy có thể tham khảo tài liệu của nhà sản xuất được cung cấp theo máy.