Kỹ thuật nhuộm Gram

1. Giới thiệu và nguyên lý:

- Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm do Gram sáng chế năm 1884. Phương pháp này giúp phân biệt vi khuẩn bắt màu Gram (Gram dương) và vi khuẩn không bắt màu Gram (Gram âm), từ đó giúp cho việc chẩn đoán xác định loại vi khuẩn.

- Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của fucshin.

2. Chuẩn bi thuốc thử

- Dung dịch tím gentian.

- Dung dịch lugol.

- Cồn tẩy 95°.

- Dung dịch đỏ fucshin pha loãng 1/10.

3. Kỹ thuật nhuộm

(1) Dàn bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên trên lam kính sạch

(2) Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội

(3) Nhuộm:

- Phủ dung dịch tím gentian, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

- Phủ dung dịch lugol để cố định màu, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.

- Tẩy màu bằng cồn 95°, để khoảng 30 giây. Rửa nước. 

- Phủ dung dịch đỏ fucshin 1/10 của Gram, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.

(4) Để khô tự nhiên

(5) Soi dưới vật kính dầu

4. Nguyên tắc nhuộm

- Nhuộm tím gentian: Nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen.

- Nhỏ legol: Gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tuỳ loại.

- Tẩy cồn 95°: Tẩy màu một số vi khuẩn mà dung dịch lugol không gắn chắc màu tím vào được. Không tẩy màu một số vi khuẩn mà màu tím đã được dung dịch lugol gắn chắc vào. 

Bước tẩy cồn rất quan trọng nên phải thật chứ ý trong quá trình nhuộm.

- Nhuộm đỏ fucshin: Nhuộm đỏ trở lại những vi khuẩn đã bị cồn tẩy màu. Không có tác dụng trên vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen.

Nguyên lý nhuộm Gram

5. Cơ chế bắt màu Gram

Có sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) về cấu tạo của lớp peptidoglycan (murein) ở thành tế bào vi khuẩn. 

- Các vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ chắc màu tím gentian và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fucshin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram (+).

- Các vi khuẩn Gram (-) có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn không giữ được màu tím gentian và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm fucshin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram (-).

Sơ đồ minh họa vách tế bào vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm (phải)

6. Đọc kết quả

- Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím sẫm gentian: Tụ cầu, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn khuẩn bạch hầu, trực khuẩn than…

- Vi khuẩn Gram (-) không bắt màu tím gentian nên có màu đỏ fucshin: Lậu cầu, não mô cầu, E. coli, Shigella, Salmonella, tả…

7. Lưu ý về nguyên nhân nhuộm sai 

Gram dương giả

- Do tiêu bản được cố định khi chưa khô, tiêu bản quá dày.

- Cặn thuốc nhuộm (phải lọc trước khi dùng).

- Đổ chưa hết lugol.

- Tẩy cồn chưa đủ thời gian.

- Dung dịch fucshin quá đậm hay nhuộm quá lâu.

Gram âm giả

- Do không thay lugol

- Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.