Định lượng các yếu tố dựa trên cơ sở xét nghiệm thời gian Prothrombin

ĐỊNH LƯỢNG CÁC YẾU TỐ DỰA TRÊN CƠ SỞ

XÉT NGHIỆM THỜI GIAN PROTHROMBIN

(Prothrombin, yếu tố V, VII và X)

1.     Nguyên lý chung

-     Thời gian prothrombin của huyết tương biểu hiện nồng độ các yếu tố V, VII, X, fibrinogen và prothrombin. Muôn định lượng một trong các yếu tố người ta theo dõi thời gian prothrombin của huyết tương với thuốc thử có dư các yếu tố khác.

-     Thuốc thử đó là các mẫu đông khô của huyết tương người không có prothrombin hoặc yếu tố V hoặc yếu tố VII được bán sẵn. Những sản phẩm này chứa hoạt tính yếu tố cần định lượng không quá 1% nhưng có đủ các yếu tố khác cần thiết cho xét nghiệm thời gian prothrombin.

-     Định lượng dựa trên sự so sánh mức độ điều chỉnh thời gian prothrombin của huyết tương thiếu hụt yếu tố đã biết sau khi thêm vào các nồng độ pha loãng của huyết tương bệnh và sau khi thêm vào các nồng độ pha loãng của huyết tương chứng.

-     Thời gian prothrombin được đánh giá bằng cách dùng thromboplastin từ óc động vật (thỏ) với CaCl₂.

Sơ đồ đông máu

2.      Định lượng yếu tố II, V, VII

2.1.      Thuốc thử, hoá chất

-      Huyết tương thiếu hụt yếu tố định kiểm tra.

-      Đệm muối barbiton

-      Thromboplastin từ óc thỏ hoặc óc người.

-      CaCl₂ M/40 ( 0,025 mol/l).

-      Huyết tương chứng.

2.2.      Tiến hành kỹ thuật

-     Pha loãng huyết tương chứng và huyết tương cần kiểm tra ở 3 nồng độ: 1/10, 1/50, 1/100 trong đệm.

-      Lấy 3 ống nghiệm, trong mỗi ống cho:

+ 0,1 ml huyết tương chứng đã pha ố các nồng độ trên + 0,1 ml huyết tương không có yếu tố kiểm tra (II hoặc V hoặc VII)

+ 0,1 ml thromboplastin

-      Để vào bình cách thuỷ 30 giây;

-      Sau đó thêm vào mỗi ống 0,1 ml CaCl₂, bấm đồng hồ theo dõi thời gian đông.

-     Kẻ đường biểu diễn giữa thời gian đông với độ pha loãng trên giấy logarit kép.

-      Tiêp tục làm như thế vói huyết tương bệnh rồi đọc kết quả trên đồ thị.

Ghi chú: có thể chuẩn bị các huyết tương thiếu các yếu tố như sau:

-     Huyết tương không có yếu tố V có thể được chuẩn bị bằng cách lấy huyết tương oxalat ủ ở 37°c trong 3 ngày trong điều kiện vô trùng (máu chống đông tỷ lệ 9: 1 với oxalat natri 14 g/1), bảo quản ở -20 °c.

-     Huyết tương không có yếu tố VII có thể chuẩn bị từ huyết tương bệnh nhân dùng Warfarin sau 48 giờ hoặc huyết tương của một loài chó có thiếu hụt yếu tố VII bẩm sinh.

-     Nọc rắn Viper Đài Loan (oxyuranus scutellatus) có khả năng trực tiếp biến prothrombin thành thrombin trong sự vắng mặt của những yếu tố đông máu đã biết nào đó. Vì thế có thể dùng nó như một thuốc thử đặc hiệu để định lượng yếu tố II một thì.

-     Bạch Quốc Tuyên và cộng sự đã sản xuất thuốc thử để định lượng yếu tố II từ huyết thanh oxalat hoá và huyết tương hút với tỷ lệ 1: 2.

-     Thuốc thử để định lượng yếu tố VII được sản xuất từ huyết tương cừu chống đông bằng wintrobe, hút bằng bột silicagen G hoặc trên màng lọc amiăng 20%.

3.      Định lượng yếu tố X

3.1.       Nguyên lý

-     Thay thế thromboplastin trong thời gian Quick bằng nọc rắn hổ mang Russell pha loãng ta sẽ có thời gian đông dài hơn. Nọc rắn hoạt hoá rất mạnh yếu tố X mà không cần sự tham gia của yếu tố VII.

-     Để định lượng yếu tố X, người ta dùng một thuốc thử đó là huyết tương bò lọc qua than hoạt. Thuốc thử này thiếu hụt cả hai yếu tố VII và X. Nhưng nếu thay thromboplastin bằng nọc rắn Russell để xét nghiệm thời gian prothrombin, yếu tố VII thiếu hụt sẽ không ảnh hưởng đến kết quả.

-     So sánh thời gian prothrombin với nọc rắn Russell của thuốc thử nhờ yếu tố X của huyết tương chứng và bệnh để biết nồng độ yếu tố X của bệnh nhân.

3.2.       Thuốc thử, hoá chất

-      Huyết tương bò lọc amiăng ( không có yếu tố X )

-      Dung dịch nọc rắn Russell 1/150000 pha với cephalin.

-      Cephalin pha với đệm muối pH 7,4 để có nồng độ thích hợp.

-      Huyết tương citrat của chứng và bệnh.

-      CaCl₂ M/40

-      Ống nghiệm, pipette, thùng cách thuỷ, đồng hồ bấm giây.

3.3.       Tiến hành kỹ thuật

-     Pha loãng huyết tương chứng và bệnh 1/10, 1/100, 1/1000 trong đệm muối pH 7,4.

-    Cho vào mỗi ống nghiệm 0,1 ml huyết tương bò không có yếu tố X, 0,1 ml huyết tương chứng và bệnh pha loãng ở các nồng độ và 0,1 ml thuốc thử gồm nọc rắn với cephalin.

-      Để vào thùng cách thuỷ.

-    Sau đúng 30 giây cho thêm 0,1 ml CaCl₂ M/40, bấm đồng hồ theo dõi thời gian đông. Làm mỗi ống của mỗi nồng độ lặp lại 2 lần.

3.4.       Kết quả

-     Thời gian đông của các nồng độ huyết tương chứng sẽ được vẽ thành đường thẳng trên giấy logarit kép.

-    Hoạt tính yếu tố X của bệnh có thể đọc trên đồ thị theo kết quả thời gian đông của ống có huyết tương bệnh pha loãng 1/10.

4.      Nguyên nhân sai lầm

(của định lượng các yếu tố dựa trên cơ sở thời gian prothrombin).

Ngoài những nguyên nhân chung như lấy bệnh phẩm không chính xác, dụng cụ không sạch, ỏ đây cần chú ý đến chất lượng của thuốc thử: nếu trong đó còn nhiều yếu tố mà ta cần loại trừ, kết quả sẽ không chính xác.