Định lượng sản phẩm thoái hóa Fibrinogen và Fibrin (FDP)

ĐỊNH LƯỢNG SẢN PHẨM THOÁI HÓA FIBRINOGEN VÀ FIBRIN

(Fibrinogen and fibrin degradation products - FDP)

-      FDP có mặt nhanh chóng trong máu ở cả hai trường hợp: tiêu sợi huyết toàn thể và tiêu sợi huyết cục bộ kết hợp với sự lắng dọng fibrin trong lòng mạch (có đông máu trong lòng mạch).

-      Trong máu người bình thưòng có thể có FDP dưới dạng vết, đó là kết quả của tiêu sợi huyết sinh lý. FDP cao hơn trong thời kỳ kinh nguyệt, đặc biệt ỏ người rong kinh. FDP cũng tăng ở người xơ gan, tắc mạch, nhồi máu phổi và trong bệnh nhân ghép thận, ở bệnh nhân ghép thận, tăng FDP trong míổc tiểu là biểu hiện của tình trạng thải ghép.

-     FDP cản trở phản ứng thrombin - fibrinogen, làm kéo dài thời gian thrombin huyết tương. Huyết thanh có FDP sẽ làm tăng nhanh sự kết tụ của tiểu cầu.

-      Phương pháp miễn dịch là phương pháp nhạy nhất để xác định FDP.

Nguồn Internet

1.      Định lượng FDP dựa vào phương pháp miễn dịch ức chế ngưng kết hồng cầu của Merskey

1.1      Nguyên lý

FDP có tính kháng nguyên, sẽ phản ứng với kháng thể kháng fibrinogen người. Khi cho vào huyết thanh có FDP, kháng thể kháng fibrinogen người sẽ bị trung hoà và do đó giảm khả năng ngưng kết hồng cầu được gắn fibrinogen (ức chế ngưng kết hồng cầu).

1.2.         Chuẩn bị thuốc thử, hoá chất và dụng cụ

1.2.1.        Thuốc thử

-      Dung dịch đệm pH   7,2

+   KH₂PO₄0,15M        23,9 ml

+   Na₂HP0₄ 0,15 M     76 ml

+   NaCl 0,85 %            100 ml

-      Dung dịch đệm phosphat citrat pH 6,4 + 0,35 thể tích Na₂HP0₄ 0,15 M

+ 0,65 thể tích KH₂P0₄ 0,25 M + 1 thể tích natri citrat 0,1 M

1.2.2.        Huyết thanh người bình thường và huyết thanh bệnh

-     Lấy 3 ml máu không chống đông vào ống nghiệm có sẵn 10 mg chất ức chế: acid amino caproic (hoặc chất ức chế Kuniet).

-      Để ở thùng cách thuỷ 37°c trong 3 giờ.

-      Quay ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, tách lấy huyết thanh.

1.2.3.        Huyết tương chứng

-     Trộn huyết tương citrat của những người bình thường cùng nhóm hồng cầu hệ ABO.

-     Ly tâm mạnh 3000-5000 vòng/phút trong 20 phút. Bỏ cặn, định lượng fibrinogen trong huyết tương đó.

1.2.4.        Huyết thanh chống fibrinogen người

-     Tiêm fibrinogen ngưòi cho thỏ tạo kháng thể. Khi có hiệu giá cao đạt yếu cầu thì lấy máu thỏ không chống đông, thu huyết thanh, kiểm tra bằng điện di miễn dịch và hiệu giá kháng thể trưốc khi lưu trữ.

1.2.5.       Hồng cầu người nhóm O hoặc hồng cầu cừu

-     Lấy 20ml máu, chống đông bằng 3 ml ACD hoặc citrat, máu để lưu trữ 2 ngày trưóc khi cảm nhiễm.

-      Xử lý hồng cầu với acid tank 1/200.000:

+ Rửa hồng cầu 7 lần bằng đệm pH 7,2.

+ Pha hồng cầu 5% trong đệm pH 7,2

+ Xử lý với acid tanic: 1 thể tích hồng cầu 5 % với 1 thể tích acid tank 1/200.000, để ở nhiệt độ phòng (có thể trong giới hạn 22- 37°C) trong 20 phút.

-     Rửa hồng cầu 3 lần bằng đệm pH 7,2 và cuối cùng pha thành hồng cầu 5 % trong đệm.

1.2.6.        Dụng cụ vi ngưng kết, khay nhựa nhiều hàng lỗ

1.3.        Tiến hành kỹ thuật

1.3.1.        Hiệu giá kháng thể

-      Cảm nhiễm hồng cầu

+ Hồng cầu 5% tiếp xúc với huyết tương người pha loãng 1/250 trong dung dịch đệm pH 7,2.

+ Hồng cầu 5% tiếp xúc với huyết thanh pha loãng 1/250

(1 thể tích hồng cầu, 1 thể tích huyết tương hoặc huyết thanh pha loãng 1/250 ủ ở 37°c trong 30 phút).

+ Rửa hồng cầu 3 lần rồi pha lại 5%.

-      Chọn nồng độ kháng huyết thanh

+ Pha loãng kháng huyết thanh bằng dung dịch đệm pH 7,2 có chứa 1% gelatin trên hai hàng lỗ.

+ Hàng lỗ 1 sẽ có thêm hồng cầu 5% đã tiếp xúc với huyết tương pha 1/250 + Hàng lỗ 2 có thêm hồng cầu đã tiếp xúc với huyết thanh pha 1/250 + Để ỏ nhiệt độ phòng, sau 1-2 giờ đọc ngưng kết

+ Nồng độ kháng huyết thanh được dùng là nồng độ lớn hơn 2 độ pha loãng so với độ pha loãng cuối cùng còn ngưng kết.

1.3.2.        Định lượng FDP

-     Pha loãng huyết tương chuẩn (Pool đã được định lượng fibrinogen) trong đệm pH 7,2 có 1 % gelatin với nồng độ: 1/30, 1/90, 1/270, 1/540.

(Với các mẫu kiểm tra và huyết thanh bình thường (có chất ức chế) thì pha 1/3, 1/9, 1/27...).

-     Cho 0,05 ml huyết thanh ỏ hiệu giá đã chọn vào mỗi lỗ ủ 10-30 phút ở 4°c, thêm vào mỗi lỗ 0,05 ml hồng cầu 5% đã cảm nhiễm để nhiệt độ phòng 2 giờ.

1.4.      Kết quả

-      Chứng dương là hàng có huyết tương chuẩn.

-      Chứng âm là hàng có huyết thanh người bình thường.

-     Mức độ ngưng kết ở độ pha loãng của mẫu cần kiểm tra được so sánh với huyết tương chuẩn.

Thí dụ; huyết tương chuẩn có chứa 300mg/l, fibrinogen ức chế độ ngưng kết ở 1/600 thì mỗi độ pha loãng sẽ là:

1000        1

300 X -----  X ------  = 0,5pg/ml

100         6000

Nếu ức chế ngưng kết xảy ra ở 1/80 của hàng mẫu cần kiểm tra thì trong mẫu sẽ có 0,5pg/ml X 80/l =40µg/ml FDP.

Binh thường trong huyết thanh có từ 0-5pg/ml.

1.5.      Nguyên nhân sai lẩm

-      Nồng độ acid tanic không thích hợp để xử lý hồng cầu

-      Kháng huyết thanh không đảm bảo chất lượng.

2.       Định lượng FDP bằng phương pháp ngưng kết latex

2.1.      Nguyên lý

Khi trộn huyết thanh hoặc nưóc tiểu vói dịch treo cổ hạt latex đã gắn kháng thể đặc hiệu chống FDP, nếu có hiện tượng ngưng kết, nghĩa là trong huyết thanh hoặc nước tiểu có FDP. Phương pháp bán định lượng được tiến hành bằng cách pha loãng mẫu xét nghiệm ở các nồng độ khác nhau.

2.2       Thuốc thử, hoá chất

Dùng thrombo-wellcotest kit (Wellcome reagents LTD. Beckenham, Kent).

2.3.      Tiến hành kỹ thuật

-      Tách huyết thanh:

+ Lấy 2 ml máu vào một ống nghiệm chuyên dụng cho xét nghiệm FDP (có chứa thrombin và chất ức chế tiêu đạm để máu đông nhanh và ngăn ngừa tiêu sợi huyết invitro).

+ Để ống máu vào thùng cách thuỷ 37°c cho đến khi cục máu bắt đầu co, quay ly tâm tách lấy huyết thanh để làm xét nghiệm.

-      Thực hiện phản ứng:

+ Pha loãng huyết thanh 1/5, 1/20 với đệm glycin có trong bộ kit.

+ Lấy một giọt hỗn dịch ở mỗi độ pha loãng của huyết thanh nhỏ vào phiến kính với một giọt dịch treo latex. Lắc phiến kính nhẹ nhàng cho đến khi nhìn thấy ngưng kết các hạt latex bằng mắt thương (thời gian không quá 2 phút).

-     Nếu chất xét nghiệm là nước tiểu cũng làm tương tự như huyết thanh: cho 2 ml nước tiểu vào ống chuyên dụng, đặt vào thùng cách thuỷ 37°c khoảng 30 phút, sau đó lọc nước tiểu qua giấy lọc hình đĩa (Whatman GF/B). Thực hiện phản ứng với nước tiểu không pha loãng và pha loãng 1/5.

2.4.      Kết quả

-    Huyết thanh: nếu xuất hiện ngưng kết ở độ pha loãng 1/5 thì lượng FDP trong huyết thanh không quá 10 mg/ml, nếu ngưng kết ở độ pha loãng 1/20 thì lượng FDP trong huyết thanh không quá 40 pg/ml.

-    Nưốc tiểu: Nếu ngưng kết ở nước tiểu không pha loãng thì FDP không quá 2 µg/ml, nếu ngưng kết ở độ pha loãng 1/5 thì FDP không quá 10 mg/ml nước tiểu.

-     Kết quả của phương pháp dùng latex tương tự với phương pháp dùng hồng cầu xử lý bằng acid tanic nhưng nó cho kết quả nhanh và tiện cho những phòng xét nghiệm không làm thường xuyên.