1. Tổng quan
về các kỹ thuật dùng trong xét nghiệm đếm tế bào T-CD4
 |
| Hình 1. Các loại tế bào có thể phân tích bằng máy đếm tế bào dòng chảy |
Tiếp đến, xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4 dựa trên kỹ thuật đếm tế
bào dòng chảy (flow cytometry) ngày càng trở nên phổ biến và cho đến nay phương pháp này được xem như là phương pháp chuẩn mực cho xét nghiệm đếm tế
bào
lympho T-CD4.
Phương pháp đếm
tế bào dòng chảy (flow cytometry) là một phương pháp
dùng để phân tích đồng thời các
đặc điểm lý hóa của từng tế bào đơn với tốc
độ phân tích từ vài trăm đến vài ngàn tế bào trong một giây.
Phương pháp đếm tế bào dòng chảy là phương pháp có độ tin cậy cao đồng thời có thể thực hiện được một số lượng lớn xét nghiệm trong ngày. Các dòng máy được sử dụng phổ biến tại Việt Nam như FacsCalibur, Cytomics FC500, Partec Cyflow Coulter, FacsCount. Riêng dòng máy Guava PCA, mặc dù cũng sử dụng nguyên lý đo dòng chảy tế bào nhưng có điểm khác biệt là thay vì sử dụng dung dịch tạo dòng bao thì lại sử dụng ống vi mao có tiết diện nhỏ để tạo dòng tế bào đơn.
Ngoài ra, hiện tại ở Việt Nam
dòng
máy Pima analyzer bắt đầu hiện diện
trên thị trường. Đây là dòng máy đếm tế bào lympho T-CD4 có nguyên lý khác
với nguyên lý đo dòng chảy tế bào, sử
dụng các con chíp vi mạch kết hợp với các kỹ thuật phân tích hình ảnh.
Việc triển khai dòng máy đếm tế bào nào tại cơ sở phụ thuộc rất lớn vào
các điều kiện như số lượng mẫu, trình độ của kỹ thuật viên thực hiện, điều kiện lấy
và vận chuyển mẫu, thờ, điều kiện bảo trì bảo dưỡng thiết bị... Cho nên, các đơn vị khi triển khai
xét nghiệm đếm tế bào lympho T
CD4 cần xem xét điều kiện thực tế của đơn vị mình để áp dụng các
hệ thống máy phù hợp.
2. Lịch sử về máy đếm tế
bào
theo nguyên
lý dòng chảy
Năm 1969, Lou Herzenberg phát minh ra kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào
việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang (đèn
argon) và phát triển thiết bị phân loại tế bào dựa
trên kích hoạt huỳnh quang (FACS - Fluorescent Activated Cell Sorter).
Đến năm 1990, Becton Dickinson (BD) tung ra thị trường máy FACSCount
chuyên dụng cho đếm
T-CD4, tại thời điểm đó, máy chưa được cấp giấy chứng nhận bởi FDA nhưng hiện nay đã được FDA công nhận. Năm 1996, BD tiếp tục đưa ra hệ thống FACSCalibur, và sau đó là các dòng máy
FACS Canto,
FACS Aria hiện đại và đa nhiệm.
Năm 1996, Công ty Guava cũng bắt đầu giới thiệu dòng máy đếm tế bào đầu tiên của hãng.
Năm 1999, Beckman Coulter công bố về dòng máy EPICS XL và năm
2003 cho ra đời dòng máy
Cytomics FC500 và sau đó là các dòng máy Navious, Galious và Mo-Flow với các chức năng ngày càng hiện đại và tính đa nhiệm ngày
càng cao.
Năm 1998, hãng Partec sản xuất ra máy đếm
CyFlow. Và năm 2000, cho ra
dòng máy CyFlow SL, và sau này có
dòng máy đa nhiệm CyFlow Space.
Năm 2002, Guava
đưa ra dòng máy PCA.
Năm 2004, Guava cho ra đời dòng máy Guava EasyCD4 chuyên dùng cho đếm tế bào T-CD4.
3. Các
bộ
phận chính
và nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy
3.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)
Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm
tế bào dòng chảy. Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm
có 2
vùng chất lỏng có áp lực
khác nhau. Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là
dung dịch tạo
dòng bao: có tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế
bào/vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế
bào đơn này đi qua hệ thống quang học với tốc độ rất cao, khoảng
1000 tế bào/giây.
Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng
hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp). Nhờ cơ chế
này hệ thống mới có thể phân tích đồng thời nhiều đặc tính trên từng tế bào một
cách chính xác, giảm
được yếu tố nhiễu. Dịch dùng tạo dòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu: (1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan tế
bào); và
(2) không
là ảnh hưởng đến độ
chiết quang và độ
huỳnh quang của hệ
thống. Ở
một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế
cho dòng bao.
Hình 2. Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow
cell)
3.2. Hệ thống quang học
Bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser hoặc đèn hồ quang), hệ
thống kính lọc và
các kênh thu
tín
hiệu quang
học
và tính hiệu huỳnh quang
(FSC – Forward Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc
thẳng; SSC – Side Scatter Chanel, dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL
(Fluoressen Light), dùng thu nhận
tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ
kênh màu huỳnh quang và số kênh màu huỳnh quang có thể dao động từ 2 đến 18 FL tùy
dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng
với các kênh màu huỳnh quang có vai
trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh
quang).
Khi một tế
bào
hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng sẽ
tương tác với vật thể sẽ
tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ
góc
thẳng và tán xạ
góc bên) và nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm
màu
huỳnh quang, dưới kích thích
của nguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ
phát ra ánh sáng huỳnh quang. Sau đó các tia sáng này
sẽ
đi qua hệ thống kính lọc (đó là các thấu kính chỉ cho phép
các tia sáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua). Với hệ thống kính lọc này các tia
sáng tán xạ và ánh sáng
huỳnh quang
sẽ được phân chia và đi đến hệ
thống thu nhận tín hiệu một cách chính xác.
 |
| Hình 3. Hệ thống quang học |
Ánh sáng từ nguồn laser tương
tác với
tế bào
nhuộm kháng
thể gắn huỳnh
quang sẽ sinh ra các ánh sáng sau:
FSC liên quan tới kích cỡ tế bào, SSC
liên quan đến độ phức tạp
nhân và bào tương
tế bào, các ánh sáng huỳnh
quang như FITC, PE, PC5 đặc trưng cho
các kháng nguyên
tương ứng có trên bề mặt tế bào.
3.3. Hệ thống điện tử (electronics system)
Hệ thống điện tử về
bản
chất là một hệ
thống có trong máy, các tín hiệu của
ánh
sáng tán xạ và
tín
hiệu huỳnh quang sau khi được
khuếch đại ở PMT sẽ
được
hệ
thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm
được và được biểu hiện dưới
dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm
trên
máy tính thông qua các phần mềm chuyển đổi
chuyên dụng theo máy.
|
4. Cơ chế nhuôm kháng nguyên bề mặt
tế bào và quá trình
thu nhận tín hiệu
4.1. Cơ chế nhuộm kháng nguyên
bề mặt
Trên bề mặt các tế bào đích có các kháng nguyên đặc trưng cho từng quần
thể tế bào. Ví dụ: trong trường hợp tế bào T-CD4 sẽ có các
kháng nguyên đặc trưng là CD3 và CD4. Thông qua việc xác định sự hiện diện các kháng nguyên
trên bề mặt tế bào này, người ta có thể xác định sự
có mặt cũng như số lượng và phần trăm các
tế bào đích tương ứng trong quần thể tế bào phân tích.
Thông thường, người ta sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có khả
năng gắn đặc hiệu với các kháng nguyên bề mặt tế bào. Khi được ủ
với mẫu phân tích, các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát
huỳnh quang sẽ
gắn
đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng chúng có trên bề mặt tế bào.
 |
| Hình 5. Nhuộm kháng thể đơn dòng |
Kháng thể đơn dòng
có gắn
chất phát huỳnh
quang sẽ
gắn vào kháng
nguyên
tương ứng nằm
trên
tế bào đích trong quá trình ủ.
Các tế bào có kháng bề mặt được gắn đặc
hiệu với kháng thể
có gắn chất
phát huỳnh quang khi đi qua chùm tia laser, chất phát huỳnh quang tiếp xúc và
hấp thụ năng lượng cao từ
nguồn sáng sẽ bị kích thích và giải phóng ra ánh sáng
huỳnh quang để trở về trạng thái năng lượng thấp hơn. Các ánh sáng huỳnh quang sẽ qua hệ thống kính lọc được thu nhận bởi hệ
thống thu nhận tín hiệu quang học
của máy tại những kênh thu tín hiệu huỳnh quang (FL) xác
định.
4.2. Quá trình
thu nhận tín hiệu
Tế bào/vật
thể nhỏ khi di chuyển qua nguồn sáng
sẽ
tương tác với tia laser
và sinh ra các
tín hiệu sáng:
 |
| Hình 6. Hệ thống quang học và hệ thống điện tử thu nhận tín hiệu |
Ánh sáng tán xạ góc thẳng sẽ
được thu nhận qua các
kênh FSC (Forward Scatter Chanel). Do được thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sánh nguồn, ánh sáng tán xạ
góc thẳng phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích
(hình minh họa). Ánh sáng tán xạ
góc bên sẽ được thu nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel). Do được thu nhận ở góc bên (90 độ) theo trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ phức tạp
nhân và bào tương của
tế bào.
 |
| Hình 7. Tán xạ ánh sáng tia laser theo trục thẳng và vuông góc tạo thông số FSC và SSC |
Nếu tế bào có kích thước
càng lớn, chỉ số FSC thu được
càng lớn. Tế bào càng nhiều hạt hoặc
khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ số
SSC càng cao. Như vậy, trong các thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC của quần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần thể mono cao hơn quần thể
lympho, và
SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất.
 |
| Hình 8. Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồng cầu cho thấy các quần thế tế bào bạch cầu đượcphân tách thành 3 quần thể rõ rệt theo kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào. |
Quần thể bạch cầu hạt trung tính có kích
thước
từ độ
phức tạp nhân và bào tương
đa dạng từ mức trung bình đến cao.
Quần thể monocyte có
kích
thước lớn hơn lympho, độ phúc tạp
nhân và bào tương
ở mức trung bình thấp.
Quần thể lympho có kích thước nhỏ nhất, nhân và bào tương đơn
giản nhất
Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng
thể kháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh quang và được khuếch đại
trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube).
Khi
tia laser
chiếu vào các
chất phát huỳnh quang
này sẽ
tạo
ra các
ánh
sáng huỳnh quang và sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tín hiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm
tính với các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát.
 |
| Hình 9. Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích. |
Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đèn huỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang cũng có đôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợp màu huỳnh quang trong các phân tích đa màu.
Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc thẳng, ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sáng huỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này với các nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể mong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn.
5. Ứng dụng của máy đếm tế
bào
theo nguyên
lý
dòng chảy
5.1. Ứng
dụng
Có rất nhiều ứng dụng trong chẩn đoán lâm
sàng và trong nghiên cứu được
triển khai trên máy đếm tế
bào
dòng chảy:
- Xác định sự biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế
bào lympho T-CD4, xác định các dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm
tế
bào hồng cầu lưới, định danh vi khuẩn, nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động , thực vật...
- Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc
sản xuất kháng
thể
đơn dòng, các quần thể tế bào miễn dịch cho nuôi cấy tương tác invitro, thu
nhận tế
bào
gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc
Y.....
- Phân tích chu kỳ ADN/ tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bất thường trong bộ nhiễm sắc thể, xác đinh tổn thương ADN,
nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích...
- Phát hiện cytokine:
định lượng nồng độ cytokine trong dung dịch bằng kỹ thuật dùng hạt bi có gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với phổ cytokines. Xác định tế bào đích sản xuất các cytokine và bán định lượng thông qua kỹ
thuật đo cytokine nội bào...
- Ngoài ra, kỹ
thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiên cứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH
nội bào,
ảnh
hưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào...
5.2. Đếm tế
bào
lympho T-CD4 kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy
Ứng dụng của nguyên lý tế bào dòng chảy được dùng trong việc xác định số lượng tuyệt đối và phần trăm số lượng tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn
phần còn được gọi là xét nghiệm đếm tế bào lympho T-CD4.
Để xác định
được
quần thể tế
bào
lympho T-CD4 trong máu toàn phần, các hãng khác nhau sử dụng các chiến lược tạo cổng, kháng thể và cách thức tính số lượng tuyệt đối tế bào khác nhau để xác định số lượng và phần trăm tế bào
lympho T-CD4 có trong máu toàn phần.
Số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 trong máu toàn phần thường có thể xác định thông qua việc sử dụng các hạt bi với số lượng xác định hoặc đo chính xác thể tích mẫu phân tích chính xác.
Với nguyên lý đo thể tích, thông thường nhà sản xuất thiết
kế
máy có khả
năng đo chính xác một lượng thể
tích nhất định, sau đó căn cứ trên số tế bào thực tế đếm
được, độ pha loãng và thể tích mẫu máu ban đầu cho vào để tính toán số lượng tuyệt đối lympho T-CD4/µl.
Trong khi đó, với nguyên lý xác định thể tích dựa trên bi chuẩn. Ban đầu nhà sản xuất hay người sử dụng cho một lượng bi chuẩn với số lượng biết trước vào trong ống tuýp xử lý mẫu. Sau khi trộn đều với mẫu máu, hỗn dịch tế bào máu và bi chuẩn xem như đồng nhất. Trong quá trình đếm, máy sẽ đếm được một lượng nhỏ xác định bi chuẩn và tế bào máu. Từ các thông số trên, máy sẽ tính toán ra giá trị số lượng tuyệt đối lympho T-CD4
Các máy đếm tế bào lympho T-CD4 chuyên biệt có thể cho cả giá trị phần trăm
và
giá trị tuyệt đối của tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần hay còn gọi là hệ thống 1 máy. Tuy nhiên, trong các trường hợp chỉ có thể ghi nhận giá trị
phần trăm
lympho T-CD4 hoặc số lượng tuyệt đối tế bào lympho T-CD4 trong máu toàn phần, người ta có thể kết hợp với giá trị tổng lympho bào trong máu thu nhận từ máy huyết học để có thể
xác
định thông số còn lại. Trong trường hợp sử dụng kết hợp máy đếm tế bào lympho T-CD4 và máy huyết học, người ta gọi đó là
phương pháp hai máy.
Cách tính giá trị phần trăm lympho T-CD4 khi có giá trị số lượng tế bào
lympho T-CD4 và tổng lympho bào:
5.3. Quy trình
kỹ
thuật căn bản cho xét nghiệm đếm tế
bào
lympho T-CD4 bằng kỹ thuật
đếm tế bào dòng chảy
- Khởi động máy: Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu (sheath fluid) bao gồm các bước chuẩn bị dung dịch đệm, bật máy và chọn phần mềm tương thích, rửa máy khởi động và đuổi khí trong hệ
thống buồng đếm (flow cell).
- Chuẩn máy: Thông thường các hãng khác nhau có thể sử dụng các hóa
chất tinh khiết để chuẩn máy. Chuẩn máy có thể được sử
dụng để cân chỉnh các
kênh thu
nhận tín
hiệu huỳnh quang hoặc có thể đánh giá độ chính xác của pipette
(FacsCount, Guava). Nếu máy đạt các tình trạng tốt thì tiến hành xử lý và phân
tích mẫu.
- Xử lý mẫu: Mẫu máu toàn phần với thể tích xác định theo từng quy
trình
cụ thể sẽ được ủ với kháng thể đặc hiệu để có thể phát hiện quần thể tế bào
lympho T-CD4.Tùy loại sinh phẩm được sử dụng mà kết quả thu nhận có thể có các giá trị về phần trăm lympho T-CD4, số lượng tuyệt đối lympho T-CD4 hoặc cả hai. Trong một quy
trình chuẩn, mẫu chứng nội được sử
dụng để đánh giá toàn bộ quy trình, đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm. Mẫu chuẩn hoặc
mẫu
chứng phải được đưa vào phân tích đầu tiên và được đánh giá kết quả trước khi phân tích mẫu bệnh nhân.
- Ly giải hồng cầu: Hồng cầu trong mẫu nhuộm sẽ được ly giải trước khi đưa vào phân tích bằng các dung dịch ly giải theo bộ sinh phẩm. Sau khi ly
giải
hồng cầu, mẫu có thể được đưa vào phân tích ngay hoặc ở một số quy
trình hai
máy
thì
có thể tiến hành trung hòa và loại bỏ mảnh vỡ tế bào thông qua rửa bằng dung dịch đệm PBS với tỉ lệ
1:1.
- Chạy, phân tích mẫu và ghi nhận kết quả: Các quy trình một máy
với
bộ sinh phẩm theo máy thường được tiến hành phân tích tự động và không cho can thiệp. Tuy nhiên trong các trường hợp mẫu bất thường về hình thái cũng như mức độ nhuộm màu huỳnh quang, kỹ thuật viên cần nắm rõ các vấn đề về kỹ thuật cũng như các chiến lược tạo cổng và chọn lọc
quần thể để
tránh sai
sót có thể xảy ra. Trong một số hệ
thống máy, kỹ thuật viên phải tự phân tích và phân vùng quần
thể
để thu kết quả.
- Rửa và tắt máy: Sau quá trình chạy mẫu thì việc rửa máy
là
hết sức quan trọng,
nó giúp loại bỏ những mảng bám phát sinh trong quá trình chạy
giúp hạn
chế
tắc nghẽn hệ thống dung dịch lỏng. Dung dịch rửa máy thường đi kèm theo bộ sinh phẩm thường có bản chất là chất tẩy nhẹ như Javel,
sau
quá trình rửa
bằng
chất tẩy thì
máy bắt buộc phải rửa lại bằng nước
cất
để tránh bị ăn mòn.
6. Giới thiệu
một
số
loại máy đếm tế bào T-CD4 tại Việt
Nam
Hiện có rất nhiều dòng máy hiện diện tại các phòng xét nghiệm đếm tế bào
lympho T-CD4. Các máy đếm tế
bào
chuyên dụng có thể kể đến như:
-
FacsCalibur - Becton Dickinson (Mỹ).
-
Cytomics EC500 - Beckman Coulter
(Mỹ).
-
Máy Facs Count - Becton Dickinson (Mỹ).
-
Máy Cyflow SL3, CyFlow Counter - Partec (Đức).
-
PCA – Guava – Milipore (Mỹ).
-
Pima
analyser – Alere – (Anh).
Bảng tổng hợp so sánh
các dòng máy đếm tế
bào
Lympho T-CD4
Tên
máy
|
Kỹ thuật
|
Chứng nhận
|
Công suất
máy theo nhà
sản xuất
|
Các chỉ tiêu có thể thu thập
|
BD- FacsCalibur
|
Đếm tế bào dòng chảy, sử
dụng hạt bi
|
FDA
|
200-300
mẫu/ngày
|
CD4 tuyệt đối,
%, phân tích biểu hiện thụ thể, phân tích ADN...
|
Cytomics
FC500
|
Đếm tế bào dòng chảy sử
dụng hạt bi
|
FDA
|
300-350
mẫu/ngày
|
CD4 tuyệt đối,
%, phân tích biểu hiện thụ thể, phân tích ADN...
|
Partec Cyflow
Counter
|
Đếm tế bào dòng chảy, đo
thể tích chính
xác
|
CE- IVD
|
200-250
mẫu/ngày
|
CD4 tuyệt đối,
%
|
BD- FacsCount
|
Đếm tế bào dòng chảy, sử
dụng hạt bi
|
FDA
|
50-60
mẫu/ngày
|
CD4 tuyệt đối,
%
|
Guava-PCA
Auto CD4/CD4%
|
Đếm tế bào dòng chảy, đo
thể tích chính
xác
|
CE- IVD
|
50-60
mẫu/ngày
|
CD4 tuyệt đối,
%
|
Pima
Analyser
|
Phân tích hình
ảnh, đo thể tích
chính xác
|
CE- IVD
|
20-25
mẫu/ngày
|
CD4 tuyệt đối
|
No comments:
Post a Comment